环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用效果分析
文章导读:选取我院2013年11月至2015年2月收治的性病患者126例为研究对象,对生殖道分泌物进行检测,同时采用LAMP法、涂片检测和细菌培养方法,分析阳性检测结果和敏感性、特异性。结果:取扩增产物进行酶切片段检测,酶切片段与理论预计相符合,AluI酶切片段包括139bp、70bp,TaiI主要片段包括196bp、160bp、144bp,环介导等温扩增法和PCR检测阳性率无明显差异(P>0.05),环介导等温扩增法、PCR检测HPV敏感性无统计学差异(P>0.05),环介导等温扩增法检测CT、淋球菌和TP敏感性均高于PCR检测。 |
临床常见性病包括非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣、淋病、梅毒等,相关资料显示,性病发生率呈现逐渐上升的趋势,对人们健康带来极大危害,分析性病病原菌诊断方法有重要意义。传统性病检测方法比较麻烦,不利于性病的早期诊断和治疗。环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是近几年出现的一种新型检测方法,敏感性和特异性较高。为分析环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用效果,以我院收治的性病患者为研究对象,现报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
随机选取我院2013年11月至2015年2月收治的性病患者126例为研究对象。入选标准:曾经不洁性生活史;生殖道明显脓性分泌物;获得医院伦理委员会批准;患者均签署知情同意书。所有患者均存在不同程度泌尿生殖道感染,排除其他细菌感染性疾病。男67例,女59例,年龄26~64岁,平均年龄(37.5±6.8)岁,经荧光PCR诊断41例人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染,39例淋球菌感染,46例沙眼衣原体(chlamydiae trachomatis,CT)感染。主要试剂:限制性内切酶(Promega公司,20130605),病毒DNA提取试剂盒(四川天泽公司,20110502),DNA Maker I(天跟公司,20130204),Taqplus DNA聚合酶(北京鼎国公司,20130105)。
1.2 方法
患者均采取LAMP法、PCR法(聚合酶链反应)检测病原菌。由门诊医生对患者外阴部病灶部位涂抹,置于试管中送检。将送检标本充分震荡悬浮,离心取沉淀,加入病毒DNA提取液充分混合均匀,加入异丙醇,摇荡均匀后离心,取沉淀,加入乙醇洗涤,取沉淀,酒精挥发后加入TE溶液充分溶解。取反应杯加入对应DNA提取液,加入相应引物,65℃孵育,放在80℃ 2min灭活酶。250nm测定DNA提取液的DNA浓度,稀释调整浓度,分别用LAMP和PCR检测。LAMP检测:取反应杯,分为两组各10只,标记,1~6号杯为确定临床阳性标本,7~10号杯为阴性对照标本,各加入DNA提取液,分别加入引物和其他试剂,孵育扩增。取1 μL扩增液和缓冲液,至于琼脂糖凝胶中,70V电泳60min后置于凝胶成像系统中成像,呈现特征性梯状区带为阳性。取电泳结果为阳性扩增也进行酶切分析,分别在基因区域Alu和TaiI酶切点进行分析。PCR诊断:PCR反应物浓度为10mM,取酶标物标记引物,加入模板中,加入灭菌石英水,35个循环,在扩增管中加入变性液,取试验用杂交探针序列,人工合成通用探针,放在为孔板上,将探针固定。微孔板加入杂交液,分别加入探针工作液,加入杂交液,扩征后PCR变性产物30μL,洗板液清晰,排干,加入显色液,在酶标仪450nm处读数,<0.5为阴性,>0.8为阳性。
1.3 观察指标
分析两种检测方法阳性率、敏感性和特异性。
1.4 统计学分析
采用SPSS19.0统计学软件,检测阳性率、检测敏感性和特异性均采用百分比表示,采用χ2值检验,以α=0.05作为检验标准,P<0.05表示有统计学差异。
2 结果
2.1 酶切结果
取扩增产物进行酶切片段检测,酶切片段与理论预计相符合。
2.2 病原菌检出率情况比较
LAMP检测阳性率显著高于PCR检测阳性率无统计学差异(P>0.05)。
2.3 敏感性和特异性分析
LAMP、PCR检测HPV敏感性无统计学差异(P>0.05),LAMP检测CT、淋球菌和TP敏感性均高于PCR检测。PCR检测病原菌特异性Cutoff值均小于0.50。
3 讨论
性病逐渐受到人们的重视,传统性病病原体检测方法包括涂片镜检法、免疫学检测、PCR检测等,涂片镜检法直接将各种分泌物涂片显微镜下观察判断,对实验要求不高,多用于男性急性淋病检测,但是敏感性和检测阳性率不高。免疫学检测方法特异性和灵敏度均为100%,但是高抗体滴度患者敏感性较低,而且IgG基因突变可能影响检测结果。PCR检测检测应用较为广泛,但是费用昂贵,存在假阳性问题。LAMP检测逐渐受到重视,本文拟分析LAMP检测在性病病原体中的应用。衣原体是目前分离比较困难的微生物之一,泌尿生殖道CT感染检测方法中,传统细胞培养法检测敏感性、特异性都比较高,以往分析中多采用此方法检测,但是检测方法在使用中对技术人员要求比较高,难以推广使用。LAMP检测方法能够在等温条件下高效扩增DNA,与PCR检测方法相比,无关DNA对检测结果影响小,一般周围为45min,只需要达到6拷贝浓度就能够被检测出来,不少研究指出LAMP在检测衣原体中有很好的应用价值。在本组研究中可以看出,与传统PCR检测相比较,LAMP检测率更高,与以往研究结果相一致,提示LAMP有更高的应用价值。淋病是常见泌尿生殖道传染性疾病,不及时治疗可能引起不孕不育症,目前检测通常采用涂片法或者细菌培养法,慢性患者灵敏度不高,女性患者中存在假阳性问题PCR检测与传统PCR检测相比提高两个数量级,肉眼能够看到沉淀,能够在恒温下进行,只需要恒温箱就能完成检测工作。国内外学者研究发现LAMP检测细菌类病原微生物有很好效果。在本组研究中采用LAMP和PCR方法检测淋球菌,可以看出阳性率在89.7%,显著高于PCR检测,检测敏感性也高于PCR检测。尖锐湿疣主要由病原菌HPV-6和、HPV-11感染引起,近几年发病率呈现逐渐提高的趋势,研究显示高危型HPV与宫颈癌发生密切相关。在本组分析中,建立检测HPV的LAMP检测方法,将扩增产物分别与DNA序列相互补充,研究结果显示取扩增产物进行酶切片段检测,酶切片段与理论预计相符合,AluI酶切片段包括139bp、70bp,TaiI主要片段包括196bp、160bp、144bp,LAMP检测敏感性最低浓度为1pg/μL,敏感性与PCR检测方法相当,具有较高特异性和敏感性,而且能够有效区分HPV感染类型,与以往研究结果相一致,提示LAMP可以作为HPV快速检测方法。
总之,常见性病病原体采用环介导等温扩增法检测快速、直观、便捷,敏感性和特异性都较高,与传统性病病原菌检测方法相比,具有明显优势,经济适用、高效快速,无需特殊仪器,适合推广使用。
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