泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体检出率研究
文章导读:随机选取接受治疗的50名泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者、50名泌尿生殖无沙眼衣原体感染患者,对临床数据进行统计学分析,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对两组病例血清中抗外膜蛋白复合物B蛋白c端肽(OmcBc)、抗衣原体质粒编码蛋白3(Pgp3)、抗热休克蛋白60(HSP60)以及抗ct841编码蛋白(CT841)等抗体蛋白进行检测。结果:经GST Magbeads纯化处理后的GST-OmcBc、GST-Pgp3、GST-HSP60、GST-CT841以及空质粒表达的GST蛋白于SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,均呈现清晰目的条带。感染组血清中检出Pgp3抗体36例(72.0%),检出OmcBc抗体23例(46.0%),检出CT841抗体19(38.0%),检出HSP60抗体12例(24.0%);未感染组血清中仅检出HSP60抗体3例(6.0%);两组检测结果对比,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。 |
现阶段,沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)引发的泌尿生殖系感染已成为全球范围内主要的性传播疾病之一,相关医学研究结果指出,沙眼衣原体的感染率已经超过淋球菌成为性传播发病率最高的疾病,由沙眼衣原体所产生的并发症包括不孕不育、死胎、尿道炎、盆腔炎等,此类并发症临床症状错综复杂,迁延难愈。临床治疗期间,约10%~15%的患者存在持续感染、再感染情况,衣原体在不利生长的情况下,躲避宿主的防御免疫系统所衍生的一类可逆行为。沙眼衣原体的高危性、流行性已引起了世界范围内医学专家的广泛关注,针对沙眼衣原体展开了众多的研究工作。本次研究随机选取接收的50名泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者、50名泌尿生殖道沙眼衣原体未感染患者,通过对其临床资料进行综合分析,初步了解泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体的检测情况,旨在为临床检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体蛋白抗体抗原性、免疫优势提供有利依据,现内容如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
采用随机数表法随机选取2011年9月至2013年9月接收治疗的50名泌尿生殖道沙眼衣原体感染患者及50名泌尿生殖无沙眼衣原体感染者,分别为感染组与未感染组。感染组中,男性27例,女性23例;年龄范围21~56岁,平均年龄(26.9±5.1)岁;收集阳性血清50份。未感染组,男性26例,女性24例;年龄范围20~55岁,平均年龄(27.1±4.9)岁;收集阴性血清50份。两组患者年龄、性别等资料对比差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
纳入标准:(1)资料沙眼衣原体感染情况均经实验室检验证实。(2)已签署知情书并自愿参加本项研究者。排除标准:(1)不符合上述纳入标准者。(2)合并多种急慢性疾病或免疫系统疾病者。(3)严重精神疾病患者。
1.2 方法
将重组质粒转化大肠杆菌感受态BL-21细菌,经氨苄西林平板对阳性菌落进行筛选,并选取培养单菌落增殖,对新鲜菌液进行测序。选取4种有效鉴定转化的单克隆菌落置入含60g/L氨苄西林的LB液体培养基中,开展扩大培养至对数生长期操作,注入1mol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG),经2h诱导表达后,对其菌液进行离心收集,完毕后于含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中重悬,收集经离心后上清。应用GST Magbeads(选自于美国GenScript公司)对收集上清纯化开展SDS-PAGE电泳,鉴定蛋白表达。以1:4比例混合融合蛋白裂解液与磷酸盐缓冲液,应用谷胱甘肽预包被的ELISA 96孔酶标板(选自于美国Pierce公司),200μL/孔,4℃条件下过夜。阴性对照选取pGEX-6p-2空质粒表达的GST包被酶标板,每个酶标版均设两个阳性对照孔,对OmcBc及Pgp3蛋白进行包被,并将其单克隆抗体视作一抗。以1∶50∶250的比例将收集的100份血清分别与空质粒诱导表达的蛋白裂解液、1%牛血清白蛋白(BSA)于常温条件下进行2h混合震荡,作用于吸附减少血清中背景。吸附完毕后的血清视作一抗。应用1×PBS洗涤上述ELISA酶标板1次,洗涤后于常温下2.5%BSA封闭1h。注入100μL/孔,分别注入100μL OmcBc及Pgp3的小鼠源性单克隆抗体于阳性对照孔,并作为一抗,进行常温1h静置处理,应用0.05%PBST洗涤3次。应用辣根过氧化物酶(HRP)标记的阳抗人IgG、羊抗鼠IgG(选自于北京博奥森生物技术有限公司)视作二抗,100μL/孔,常温下静置0.5h,后应用1×PBS洗涤3次,蒸馏水洗涤1次。ABTS100μl/孔,显色30min。应用酶标仪读取A405值。
1.3 观察指标
研究人员对两组100例进行实验室指标检测后,根据医院血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体相关规范准则设计调查表,将各项观察指标详细记录于调查表中,通过计算机进行统计学分析。观察内容包括:血清中抗外膜蛋白复合物B蛋白c端肽(OmcBc)、抗衣原体质粒编码蛋白3(Pgp3)、抗热休克蛋白60(HSP60)以及抗ct841编码蛋白(CT841)等抗体蛋白抗体孔A值的标准差(s),阳性判定标准:A值>自身阴性对照孔A+2s。
1.4 统计学分析
研究中所得到的相关数据采用SPSS 12.0统计学数据处理软件进行处理分析,计数资料采用χ2值检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
经GST Magbeads纯化处理后的GST-OmcBc、GST-Pgp3、GST-HSP60、GST-CT841以及空质粒表达的GST蛋白于SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,均呈现清晰目的条带。感染组血清中检出Pgp3抗体36例(72.0%),检出OmcBc抗体23例(46.0%),检出CT841抗体19(38.0%),检出HSP60抗体12例(24.0%);未感染组血清中仅检出HSP60抗体3例(6.0%);两组检测结果对比,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
据世界卫生组织数据显示,世界范围内每年大约有9200万例新增长的泌尿生殖道沙眼衣原体感染,临床沙眼衣原体感染通常情况下无明显反应症状,患者无明显特征,大部分患者由于无自觉症状,极易忽视。现阶段,我国临床主要应用的临床沙眼衣原体检测试剂盒针对的抗原主要包括HSP60、脂多糖(LSP)或者MOMP等。相关医疗文献报道指出,LPS特异性不足,与相关病原体LPS抗原可存在一定程度的交叉反应;同时HSP60及MOMP也并非抗原性最高的衣原体蛋白,抗原性高于HSP60、LSP及MOMP的衣原体蛋白包括OmcBc、Pgp3、CT841等。
本次研究结果显示,经GST Magbeads纯化处理后的GST-OmcBc、GST-Pgp3、GST-HSP60、GST-CT841以及空质粒表达的GST蛋白于SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色,均呈现清晰目的条带。感染组血清中检出Pgp3抗体36例(72.0%),检出OmcBc抗体23例(46.0%),检出CT841抗体19(38.0%),检出HSP60抗体12例(24.0%);未感染组血清中仅检出HSP60抗体3例(6.0%);两组检测结果对比,数据差异具有统计学意义(P<0.05)。结合研究结果认为,Pgp3为沙眼衣原体隐蔽性质粒编码的特异性分泌性蛋白;OmcBc作为沙眼衣原体外膜所含的24个胱氨酸的膜蛋白,仅低于MOMP,其在各衣原体有着高度的保守型。虽然本次检出结果与国外研究存在一些差异,但考虑研究对象例数、地域影响,可视结果具有一定意义;CT841为沙眼衣原体基因编码29种蛋白水解酶其中之一,其与沙眼衣原体裂解细胞膜或防止沙眼衣原体原体受不良因素影响存在一定关联;HSP60为沙眼衣原体原体外膜重要构成部分,一方面其重要作用与沙眼衣原体免疫反应、免疫损伤,一方面作为集体细胞、体液免疫的主要靶点。Pgp3、OmcBc、CT841抗原性均高于HSP60,且Pgp3抗原性最高;同时Pgp3可作为临床沙眼衣原体特异性蛋白,相对于肺炎衣原体等相关衣原体种的蛋白不存在同源性,可有效作用于临床沙眼衣原体感染检测,并与国内外相关文献研究结果相符。
总而言之,泌尿生殖道沙眼衣原体感染者血清抗衣原体免疫优势蛋白抗体检测,抗衣原体质粒编码蛋白3是抗原性较强、检出率较高的衣原体蛋白之一,抗热休克蛋白60是抗原性较弱、检出率较低的衣原体蛋白之一。
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