男性不育患者年龄与精子DNA碎片和精液常规参数的相关性分析
文章导读:目的:分析男性不育患者年龄与精子DNA碎片率和精液常规参数的相关性。结果:年龄与精子活力存在负相关关系( r=-2.31, P<0.05) ,但与精子密度,精子形态和精子DNA碎片无相关性。精子密度与精子形态存在正相关关系(r=0.528, P<0.01),与精子活力存在正相关关系,(r=0.31, P<0.01)。精子DNA碎片率与精液常规各参数无相关性。结论:随着男性年龄的增长,精子的活力可能降低,并影响男性的生育力,精子DFI与精液常规各参数无相关性。故精子DNA碎片检测可作为精液常规分析的补充,进一步反映男性的生育能力。 |
DNA与精子
近年来,男性年龄对生育和子代的影响越来越受到关注。Sloter等报道随着男性年龄的增长,该男性子代患染色体缺陷的风险可能增加。de la Rochebrochard等报道男性年龄可能与自然流产相关。然而年龄对于生育影响的机制尚不完全清楚。有人认为,随着不育男性年龄的增加,精子DNA碎片率增加,从而对男性生育力产生负影响,但目前尚无定论。本研究测定了85例男性不育症患者精子DNA碎片率(DNA fragmentation index ,DFI),精子密度、活力和形态、精液量等参数,分析年龄与精子DFI和精液常规参数间的相关性,从而探讨男性年龄对于男性生育力的影响。
1 对象与方法
1.1 研究对象及分组
收集2011年1月~2011年5月来我院男科门诊就诊的不育症男性患者85例,不育的诊断标准为:婚后同居1年及以上、夫妻性生活正常,未采取避孕措施而未育者。按照年龄分成20~29岁组(n=31)、30~35岁组(n=28)、36~50组(n=26)三个组。
1.2 精液常规检查
所有研究对象均禁欲2~7d ,手淫法留取标本于洁净的塑料容器中,液化后取5μl以伟力彩色精子质量检测系统(WLJY29000型,北京市伟力新世纪科技发展有限公司)进行精液常规分析。每份标本观察6个视野。检测各组精液的精子密度、活力( a+ b级精子百分率) 和精液量等参数。精子形态采用瑞-吉染色镜检观察。
1.3 精子DNA碎片检测
采用深圳市博锐德生物科技有限公司精子DNA碎片检测试剂盒(精子染色质扩散法)。精液标本处理:新鲜精液行常规检查后用生理盐水稀释精子密度浓度至5~10×106ml。取出待测标本60μl加入已熔化的易熔凝胶管中,充分混匀,37℃孵育待用。加入30μl精子凝胶混合液于预先处理的载玻片上,盖上22 cm× 22 cm盖玻片,置于2~8℃冰箱5min,使其凝固。从冰箱中取出载玻片,小心移去覆盖在上面的盖片。将载玻片立即垂直浸入盛有反应液A的反应池内,20~28℃准确反应7min,然后将载玻片垂直浸入盛有反应液B的反应池内,20~28℃准确反应25min,再将载玻片水平浸入大量的纯化水中5min,其间换水1~2次。将载玻片依次放入70%、90%和100%乙醇中脱水各2 min。空气中自然干燥后每张载玻片以瑞氏染液15~20滴覆盖,稍等片刻再缓慢加入瑞氏缓冲液30~40滴,以洗耳球轻轻吹打混合染液,室温15min后以流水轻轻冲洗染片。自然干燥后,高倍显微镜下观察500个精子,计数存在DNA碎片的精子数量。精子DNA碎片判定标准:精子头部仅产生较小的光晕或无光晕,单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3。精子DNA碎片率(%)=存在DNA碎片精子数÷被观察精子总数×100%。
1.4 统计学分析
统计学处理采用SPSS13.0软件包,计量数据以±s表示。各年龄组组间的分析采用单因素方差分析。不育男性年龄与精子DFI,精子密度、活力、形态和精液量的相关性分析采用Pearson相关系数并进行显著性检验。P<0.05为差别具有显著统计学意义,P<0.01为差别具有极显著统计学意义。
2 结果
2.1 描述性统计及组间均数比较
共有85例患者纳入研究,各组精子DFI、精子密度、精子活力、精子形态、精液量均数和方差总结表明,单因素方差分析显示精子DFI,精子密度,精子活力及精子正常形态比率在3个年龄组组间差别无统计学意义。
2.2 相关性分析
年龄与精液参数和精子DFI相关性分析结果显示年龄与精子活力存在负相关关系( r=-0.231,P<0.05),精子密度与精子活力存在正相关关系(r=0.31,P<0.01),与精子正常形态比率存在正相关关系(r=0.528,P<0.01),,年龄与精子DFI,精子密度,精子正常形态比率相关性无统计学意义。精子DFI与精液常规各参数相关性无统计学意义。
3讨论
精子DNA的完整性是遗传物质正确传递给子代的前提,在受精和胚胎发育中发挥重要作用。许多研究表明精子DNA损伤会对自然生育,辅助生殖技术治疗结局产生负影响,并与复发性流产相关。精子DNA损伤的机制尚不清楚,可能是多因素联合作用的结果。
本实验采用SCD法检测男性不育患者的精子DFI,并对精液常规各参数进行了检测。本研究显示,年龄的增长对男性精子DFI、密度、正常形态比率和精液量影响不明显,但会引起精子活力的显著降低。精子DFI与精液常规各参数无相关性,与本实验的结果相反,Laura Vagnini等的研究结果显示随着年龄的增加,精子DFI增加(P=0.02)。然而有两点值得注意,首先,Laura Vagnini等结果显示年龄与精子DFI相关性较弱(Spearman’sr = 0.10),其临床意义有限,其次本文作者采用的是SCD法检测精子DNA碎片率,而Laura Vagnini等采用的是TUNEL法检测精子DNA碎片率。Thomas Winkle等采用SCD法检测精子DFI,结果显示男性不育患者年龄与精子DFI无相关性,与本实验结论一致。因此推测这种分歧可能是来自于检测方法的不同。TUNEL最初是用来检测细胞凋亡,其原理是在保持细胞结构的前提下,通过末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP)将荧光标记物与DNA断裂片段末端的游离氢氧根结合,流式细胞仪或光学显微镜下直接测定精子DNA单链和双链的数量。精子染色质扩散试验(sperm chromatin dispersion test , SCD)是近年来由一个西班牙团队开发,其原理是通过检测精子DNA对酸变性的易感性间接反映精子DNA的完整性。将液化后的精液与琼脂糖混合铺于载玻片上,酸变性和除去核蛋白后,经染色后显微镜下观察有DNA碎片的精子不能产生特征性的光晕,而没有DNA碎片的精子则可以产生特征性的光晕,这种方法便宜、准确,并可以在短时间内完成。以往的研究报道显示,TUNEL和SCD在精子DNA碎片率的检测上同样有效,但精子染色体扩散实验比末端转移酶介导的dUTP末端标记测定法更敏感。
综上所述,本实验结果提示随着男性年龄的增长,精子的活力降低,并对男性的生育力产生负影响。精子DFI与精液常规各参数无相关性。因而精子DNA碎片检测可做作为精液常规分析的补充,进一步反映男性的生育能力。
来自《中国性科学》杂志2012年第2期