H19差异甲基化位点MSRE-qPCR分析识别精子DNA新方法的可行性探究
文章导读:从51份血样和20份精子样本提取基因组DNA,每个样本分别在同一反应体系中进行甲基化敏感酶HhaI消化和荧光定量PCR反应(MSRE-qPCR),扩增包含上述HhaI位点的114 bp片段。得到每个样本酶切前后的Ct值,用2-△△Ct计算各样本酶切前后模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。结果:51份血样中该HhaI位点甲基化水平为(44.4±23.8)%,20份精子DNA甲基化水平为(120.5±52.5)%,差异有统计学意义(P<0.001)。 |
精液斑的检验在强奸、猥亵等性犯罪案件鉴定中具有重要作用。近年来利用核酸进行精子检测的方法时有报道:如检测精子中的特异转录的mRNA和特异的DNA差异甲基化标记位点,其均具有较高的灵敏度和特异性。但由于mRNA易于降解,而DNA差异甲基化标记位点检测法涉及毛细管电泳,其检测试剂盒昂贵。因此本研究拟采用实时荧光定量PCR技术检测H19的差异甲基化位点对精子进行鉴定。父源印迹基因H19上游差异甲基化区域是当前法医物证学研究热点之一。H19转录起始点-4906bp~-3191bp(chor11:2004477-2006247)的1.7kb区域经验证在体细胞中父源等位基因是甲基化的,而母源等位基因未甲基化;在人成熟精子细胞中是双等位基因完全甲基化。本课题组前期对该序列进行MSRE-nested-qPCR分析鉴定精子DNA,因检测所需的DNA片段在1.7kb以上,于降解检材可能不适用。上述H19序列存在四个HhaI甲基化敏感酶识别位点,本文拟通过探讨距转录起始点最近的HhaI位点(H19转录起始点-3390 bp)甲基化水平在体细胞与精子中是否存在差异以达到鉴定精子DNA的目的。利用实时荧光定量PCR技术,结合甲基化敏感性限制性内切酶,该方法扩增子大小仅为114bp,可为精子识别提供一种简便、廉价、稳定、突破降解检材限制的新方法。
1 材料与方法
1.1 样本采集
太原地区51份汉族无关个体EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝血由山西医科大学司法鉴定中心提供,20份健康男性精液样本由山西医科大学附属第一临床医院提供。其中正常精液的判断依据《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(第五版)中的标准。
1.2 试剂与仪器
根据GeneBank提供的人H19基因序列使用Beacon Design8.0软件设计引物,由上海英骏公司合成。引物序列为:F:5’-GCTTCACTGGCAAGACTACTCTTAG- 3’,R:5’-CACCTCGGGCTATTTGCTTTCTAA-3’,经blast验证,扩增片段长度为114 bp。SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒(日本Takara公司,Lot# AK7102),QuickCutTM HhaI(日本Takara公司,Lot# K2854BA),iQ5实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3 基因组DNA的提取及定量
血及精子样本基因组DNA均经过蛋白酶消化和酚氯仿抽提得到。1%琼脂糖凝胶电泳定性观察,采用Nano Drop 2000超微量分光光度计检测DNA浓度,去离子水调整终质量浓度为0.5ng/μL。
1.4 血及精子基因组DNA进行MSRE-qPCR
采集的51份血样及20份精子样本,每份样本基因组DNA在同一体系中同时进行甲基化敏感酶HhaI消化和荧光定量PCR反应(MSRE-qPCR)。预实验中我们发现模板量低至0.5 ng仍可以出现很好的扩增曲线,故对于51份血样及20份精液样本基因组DNA均采用0.5ng的模板量。20μL反应体系的成分如下:基因组DNA 1μL,SYBR Premix Ex Taq II(2×) 10μL,引物 F及R各0.8μL,QuickCutTM HhaI(Takara) 1μL,去离子水补足20μL。未酶切组不添加HhaI,其余成分同上,去离子水补足20μL。应用iQ5实时荧光定量PCR仪同时进行酶切和扩增,反应条件为:37℃ 30min(酶切完成);95℃ 30s;95℃ 5s,60℃ 30s,80℃ 5s共40个循环。本实验中引物二聚体的Tm值为75℃,扩增产物的Tm值为84℃,因此我们在上述反应条件中设定80℃作为荧光检测的温度,以有效消除引物二聚体对实时荧光定量结果的影响。每份样本设置3个复孔,每次上机扩增均设置不加入模板的阴性对照组。结果由系统自动生成,得到各样本的扩增曲线、熔解曲线及Ct值,用2-△△Ct计算各样本酶切前后模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。
1.5 测序
将qPCR产物及PrimerF、R送宝生物进行正反双向测序。测序结果与NCBI进行比对验证。
1.6 统计分析
应用SPSS 17.0软件分析数据。计量资料经Shapiro-Wilk正态性检验不符合正态分布,采用中位数±四分位数间距(M±QR)描述,组间比较采用两独立样本Wilcoxon秩和检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 实时定量PCR扩增结果
对51份血样及20份精液样本进行酶切组与未酶切组实时荧光定量PCR检测,重复3次,得到Ct值,结果证实扩增曲线完好,溶解曲线在Tm=75℃左右出现引物二聚体峰,在Tm=84℃左右出现高而尖的特异性扩增产物峰,设定80℃作为荧光检测的温度,有效消除了引物二聚体的荧光信号,仅收集特异性产物的荧光信号,实时荧光定量结果准确反映特异性扩增产物。血DNA加酶组的Ct值平均为26.3,未加酶组为27.4;精子DNA加酶组的Ct值平均为27.2,未加酶组为27.0;不加模板的阴性对照组的Ct值均大于37.0。
2.2 血及精子DNA中H19基因上游甲基化水平
我们通过HhaI+/-联合qPCR得到血与精子基因组DNA在酶切后扩增前的模板DNA相对表达量,将其作为DNA甲基化水平。精子DNA甲基化水平最低为84.7%(1例),其余均在97%以上;血DNA甲基化水平有3例极端值,在84.7%与94%之间。应用SPSS17.0软件进行统计学分析。使用Shapiro-Wilk检验对血及精子的DNA中H19基因上游甲基化水平进行正态性检验,结果表明血及精子样本均不符合正态分布(P<0.1)。以中位数±四分位数间距描述血及精子样本的甲基化水平,即血为(44.4±23.8)%,精子为(120.5±52.5)%。采用两独立样本Wilcoxon秩和检验对血及精子DNA中H19基因上游甲基化水平差异进行分析,结果表明血液样本和精子样本DNA中H19基因上游区域甲基化水平存在显著统计学差异(P<0.001)。
2.3 qPCR产物测序结果
qPCR产物的测序结果与美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对,结果显示,qPCR产物的序列与NCBI发布的序列同源性达到99%以上。
3 讨论
在涉及性犯罪案件鉴定中精斑确证是法医学检验的重要环节之一,目前法医物证实验室均配备荧光定量PCR仪器,因其灵敏度高、核酸初始模板定量的准确性、重复性高、操作无需电泳等繁杂程序、自动化程度高等受到法医学工作者的青睐,尤其在法医学微量检材定量方面有重要意义,但对于诸如法医学体液识别等的应用远未开发。本文为识别精子DNA而构建了一种依赖甲基化敏感限制性内切酶,结合荧光定量PCR技术(MSRE-qPCR)的方法,它是一种简便、廉价的特定区域DNA甲基化的评估方法。Chung报道模板DNA大于180 bp时可成功扩增160 bp的目的片段,本扩增片段为114bp,因此本文构建的方法同样适用于该位点DNA片段大于180bp的降解检材;该方法检测灵敏度为0.5ng,杨电等认为Chelex-100法提取的检材DNA在0.558~3ng之间可得到有效的STR扩增。因此,无需重新提取DNA,STR检测提取的DNA其中一部分即可用于精子的识别而不浪费宝贵检材。同时因其扩增子较小,适合于STR检测前精斑的检测。H19/Igf2印迹群定位于11p15.5,其中H19基因在父源等位基因上是甲基化的,而母源等位基因呈未甲基化状态。Naito报道了H19转录起始点-4906bp~-3191bp(chor11:2004477-2006247)的1.7kb区域含有四个HhaI甲基化敏感酶识别位点,同时证实了体细胞中包含这4个识别位点的片段呈现典型的印记基因特点,据此推断,体细胞中,该片段经HhaI消化保留一半的DNA量(父源等位基因)。Bai等研究证实人成熟精子细胞在该区域是双等位基因甲基化,并不表现为印记基因的特点,即精子细胞中,该片段经HhaI消化保留全部的DNA量。我们预计在1.7kb范围内的四个HhaI位点中至少有一个为差异甲基化位点。本文探讨H19上游1.7kb区域内距离转录起始点最近的HhaI位点(H19转录起始点-3390bp)是否存在差异甲基化。利用qPCR可对初始模板准确定量的特点,根据系统得到的加酶组与未加酶组的Ct值,判断HhaI消化后相对于消化前的DNA量比值。100%意味着双等位基因中HhaI位点不能被酶切,50%表示母源等位基因被消化使得正常qPCR扩增受阻。本研究结果表明,51份血样和20份精液样本的DNA甲基化水平均呈偏态分布,可能与样本量较少有关。精子DNA甲基化水平最低为84.7%(1例),其余均在97%以上,血DNA甲基化水平极端值有3例,最高为94%,出现的极端值未见与年龄、身体状况相关,目前原因尚不明确。虽然血样检测中存在一些极端值,但甲基化水平若高于94%仍可检测出精子DNA。血DNA甲基化水平为44.4%±23.8%,精子DNA甲基化水平为120.5%±52.5%,两者甲基化水平差异(P<0.001)可使其得到较好区分。
综上所述,H19差异甲基化区114bp序列的MSRE-qPCR分析为法医性犯罪案件中精子DNA的识别提供了新思路。
来自《中国性科学》杂志 转载请注明出处