睾丸生精细胞凋亡的基因调控
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睾丸中生精细胞通过多次有丝分裂来克隆性扩增,从精原细胞到最后产生精子是一个连续分化与成熟的动态过程。生精上皮内的支持细胞和生精细胞紧密联接,支持细胞跨越生精上皮的整个厚层,胞质延伸至近腔室,通过提供结构、激素和营养来支持生精细胞,并与精子生成有序、和谐地结合,维持种族的健康后代的延续。生精细胞不间断克隆性扩增,需要有反馈机制来平衡生精细胞的数目与支持细胞提供营养的能力。凋亡是细胞主动死亡的过程,与核内切酶活化有关,并且有特殊的生化反应与形态学改变,多数情况下是一种耗能的、需要mDNA和蛋白质合成的过程。近几年来国外学者发现精子发生过程中存在生精细胞的凋亡[1,2]。其中,精原细胞的凋亡是导致实际生成的精子数量少于按理论推算,应产生的精子数量的主要原因。在精母细胞的减数分裂过程中,由于初级精母细胞分化时间长,前细线期、偶线期、粗线期初级精母细胞均有凋亡[3]。精子细胞的凋亡则少见,可能是因为精子细胞位于曲细精管靠近管腔的部位,不易受外环境的影响所致[4]。
目前认为,不同刺激因素的激发可以导致同一类型细胞中,不同凋亡程序的激活。而精子成熟过程中不同阶段的生精细胞,也可能对同一诱发因子存在不同的易感性,激活凋亡的不同因子和途径,可以导致相同特征的凋亡表型,所以只能理解并推测生精细胞的凋亡可能由多种因素诱导并调节[4~6]。其中,基因的调节作用可能是其根本原因。以下对有关生精细胞凋亡中基因调控的研究综述如下。
1 B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,
Bcl-2)基因家族与Bcl-2相关X蛋白
(Bcl-2 associated X protein,Bax)基因 Bcl-2基因家族包括凋亡诱导因子Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bok等和凋亡抑制因子Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl等,其中以Bcl-2作为细胞生存基因的代表,而Bax作为细胞死亡基因的代表,两者表达水平的平衡结果,决定了细胞是生存还是死亡\[7\]。Bcl-2原癌基因存在于多种动物的许多正常组织内,对凋亡具有抑制作用。它不能促进细胞增殖,但能延长细胞的生命期限。Bcl-2蛋白之间常常以同源二聚体形式存在[8]。用免疫组化法检测正常人体睾丸内Bcl-2蛋白表达时发现,精子细胞呈现中度到高度染色阳性(2+~4+),而精原细胞、初、次级精母细胞、支持细胞及间质细胞绝大多数染色呈阴性[9]。 Bcl-2蛋白主要分布在生精细胞线粒体,可能通过阻止细胞内Ca2+的流动,干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化而抑制细胞凋亡。Bax则可能通过插入线粒体膜,引起细胞色素C(Cyto C)释放入细胞质而诱导生精细胞的凋亡\[7\]。Furuchi等将人的Bcl-2 cDNA转入小鼠体内,发现2周龄转基因小鼠的睾丸精原细胞有外源性Bcl-2表达;4周龄时,大量精原细胞积聚于曲细精管内,精母细胞极少。淤积于管腔的精原细胞发生凋亡,到7周龄时一些曲细精管中呈现空泡变。随着年龄的增长,精原细胞继续发生堆积和凋亡,但在一些Bcl-2表达减弱的曲细精管中,已开始恢复正常精子发生过程。实验表明,精原细胞的凋亡是哺乳动物精子发生中的正常程序,这种凋亡途径受Bcl-2的影响[10]。
Zhang等用隐睾猕猴研究发现,生精细胞受热刺激发生凋亡时,胞内Bax的总体水平不变,但伴随有Bax蛋白从胞质到胞核的重分配;胞内Bcl-2的表达水平明显提高。研究发现,酒精导致大鼠生精小管中Bcl-2表达降低,Bax表达增高,推测长期过量饮酒可能导致男性的生精功能产生影响\[7\]。Bax在某些组织细胞中,它的表达并不立即造成细胞凋亡;当细胞接受死亡信号后,它才开始发挥促凋亡作用[11]。Knudson等利用基因剔除技术培育出Bax纯合性缺失的小鼠,发现此种Bax-/-雄性小鼠的睾丸萎缩,无生育能力。其曲细精管不能根据生精上皮周期进行分期;生精细胞大都停留在前减数分裂期,这些细胞既无典型的精原细胞也无典型的前细线期精母细胞的表现,附睾和输精管内也没有精子。这些结果表明,Bax基因的缺失导致生精细胞大量凋亡,这可能是由于Bax的缺失形成不同二聚体比对之间的不平衡所致[12]。
2 Fas/FasL系统
Fas是一个有319个氨基酸组成的48000μⅠ型膜蛋白分子,属于肿瘤坏死因子与神经生长因子受体家族,在多种组织细胞中均有表达。FasL基因定位于人的1号染色体长臂2区3带,总长约8.0kb,cDNA全长1909bp,开放性阅读密码框长846 bp,含有4个外显子和3个内含子。FasL(CD95L,APO-1L,CD178)蛋白是一类含有280个氨基酸(~40kDa)Ⅱ型跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子(ITF)超家族表面分子。FasL是Fas的天然受体,能够特异性地与靶细胞膜上的Fas结合诱导细胞凋亡。这种Fas/FasL系统介导的细胞凋亡途径是哺乳动物睾丸生精细胞凋亡的一条主要途径\[13\],FasL能够特异性地与生精细胞膜上的Fas结合诱导其凋亡\[13\]。细胞凋亡途径有两条信号途径:一是胞外途径,二是胞内途径。胞内凋亡途径也称“线粒体途径”,此类信号包括辐射、损伤、药物如氧化砷等,这些信号往往通过各种机制引发线粒体功能和结构的变化,导致线粒体通透性转换孔打开,细胞色素C释放,最终致使细胞凋亡\[14\]。细胞外途径,是由FasL/Fas系统介导来完成,FasL也称“死亡信号”,故胞外凋亡途径又称“死亡信号”途径。FasL/Fas系统介导的胞外途径,它们在caspase 8(caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称,是一组有相似的氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶,与真核细胞凋亡密切相关,参与细胞因子的成熟、细胞生长和分化。在介导细胞凋亡中起重要作用\[15\]。)活化时又开始分道扬镳。细胞死亡抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL不能防止“Ⅰ型细胞”路径遭受死亡受体诱导的细胞死亡。Bcl-2、Bcl-xL能够明显抑制FasL/Fas介导的“Ⅱ型细胞”途径的细胞凋亡\[16\],且发现在Bid缺失或Bax/Bak缺失的小鼠中,FasL/Fas系统介导的“Ⅱ型细胞”途径细胞凋亡被抑制\[17\]。
3 FasL在睾丸细胞中的表达
FasL不仅在免疫细胞(T细胞)中表达,在免疫豁免的微环境如眼、脑、胎盘以及睾丸中表达丰富。支持细胞是曲细精管中的体细胞,位于曲细精管基底膜,是生精细胞的支架,为生精细胞提供营养,支持细胞间紧密连接构成血-睾屏障,为精子的生成提供免疫豁免的微环境\[13\]。FasL/Fas系统介导的胞外凋亡途径是生精细胞凋亡的一条普遍途径,膜上表达有Fas受体的生精细胞通过相邻的支持细胞或通过自身细胞表达的FasL来介导其凋亡\[13\]。Xu等采用杂交技术测出,在啮齿类成年动物的睾丸中,Fas表达于生精细胞,而FasL表达于支持细胞。普遍认为FasL定位于支持细胞;而Fas定位于生精细胞。在FasL/Fas系统介导的生精细胞凋亡中,由支持细胞分泌的FasL通过与膜上表达与有Fas的生精细胞相结合,以旁分泌形式介导生精细胞凋亡\[13\]。Kajihara等用免疫组化检测证实:FasL在正常成熟小鼠的支持细胞和生精细胞都有表达。这一结果表明FasL有可能来自支持细胞和生精细胞,它们可以通过旁分泌和自分泌的形式与生精细胞膜上的Fas受体结合,从而诱导生精细胞凋亡\[18\]。已经发现同一细胞自身的Fas和FasL交联,通过顺式触发使细胞发生“自杀(Suicide)”或分别表达Fas和FasL的相邻细胞互相交联导致“同胞残杀(Fratricide)”\[19\]。睾丸组织是机体的重要的免疫豁免区(Immune privileged sites),其免疫豁免的维持依赖于Fas和FasL分子的介导的细胞凋亡机制\[20\]。如果Fas和FasL任何一个方遭受破坏都将产生不良后果。
间质细胞除在精子发生、成熟、维持睾丸的生殖功能发挥重要调节作用外,在抗感染免疫和维持免疫豁免中亦发挥重要的免疫调节作用。张颖德证实\[21\],解脲脲原体(Uu)感染时,间质细胞可能通过改变IL-6和FasL、Fas分子的表达格局,来调节睾丸局部的抗感染免疫应答和睾丸局部的免疫豁免,从而维持两者的相对平衡,达到清除病原微生物(抗感染)、保护睾丸生理功能(免疫豁免)的双重目的\[21\]。难怪在Uu感染的患者精液进行生精细胞学分析时,可以看到间质细胞代偿性增生现象。表明间质细胞可以作为—免疫调节细胞,在抗感染免疫时,发挥免疫调节作用。作者提示:间质细胞不仅具有生殖功能还具有参与睾丸局部的免疫调节功能\[21\]。彭戈峰证实\[22\]Fas和FasL表达的强弱程度在睾丸同一细胞基本是一致的,睾丸支持细胞、间质细胞及生精细胞Fas和FasL的高表达与睾丸精子生成障碍是一致的,说明睾丸生殖细胞的过度凋亡是引起精子生成障碍的重要原因之一。Francavilla等\[23\]研究表明,在特发性低促性腺激素性腺功能低下症的病例中,Fas和FasL不表达。说明人类睾丸Fas和FasL的表达是在促性腺激素控制下实行调节,从而涉及产生精子的数量控制机制。说明Fas和FasL与激素的调控有关。
4 抑癌基因p53
p53在睾丸内主要表达于生精细胞,且在性成熟前表达量非常高,而成年后大大降低。p53是抑癌基因,可以诱导自发性和损伤性生精细胞凋亡,具体过程包括:活化和氧化还原作用相关基因,产生活性氧,氧化降解线粒体组分,使得凋亡诱导因子从线粒体释放至胞质活化Caspases\[7\]。野生型p53(wtp53)基因能促进细胞凋亡的发生。它不仅在细胞有丝分裂中发挥作用,而且在生殖细胞的减数分裂中也显现出重要功能。有研究者在4倍体的粗线期精母细胞中发现了p53蛋白的表达。Rotter等\[24\]将重组p53启动子——氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因转入小鼠生殖细胞培育出转基因小鼠,这种小鼠体内内源性p53基因的表达水平降低,小鼠睾丸实质和曲细精管管腔分布着大量的多核细胞,称为“巨细胞退变综合征”。这些巨细胞实际上是不能完成减数分裂的4倍体粗线期精母细胞,阻滞在曲细精管中,必然会从精液中排出,为此,在精液脱落细胞学的检出中,可以看到多量的巨噬细胞,实际是粗线期精母细胞蜕变而来。故p53的表达水平越低,病理损害程度越重。在p53基因纯合性缺失的小鼠睾丸中也发现了多核巨细胞,某些基因背景的p53基因纯合性缺失的小鼠易发生精原细胞瘤、畸胎瘤和不育。可见,缺乏p53表达的生殖细胞不易凋亡,这是因为缺乏p53的粗线期精母细胞不能对减数分裂DNA重组中的错误进行修复,细胞不能进一步发展成熟进行减数分裂而停滞在该阶段,阻止了凋亡的发生[24]。精液脱落细胞学分析中,可以看到阻滞在初级精母细胞粗线期时,精液生精细胞脱落出现高峰期。Kilinc等通过小鼠睾丸的精索静脉曲张模型,发现p53在该模型小鼠睾丸内的表达强度明显高于正常对照组(P=0.01)表明p53与精索静脉曲张引起的生精细胞的凋亡密切相关\[25\]。
p63基因是p53基因家族中的一员,且与p53有着相似的蛋白空间结构。p63编码两种同源基因:含有N末端区域的TAP63基因和不含此区域的DeltaNp63基因。p63蛋白分布在精母细胞和精子细胞的核周质。推测p63可能与精子细胞的增殖、分化和凋亡也有某种关系\[7\]。